1、概述

  根系是植物地下部分為適應陸地生活長期進化而形成的營養(yǎng)器官，具有支撐地上部分的基本作用，不僅在水、礦物質(zhì)和碳水化合物的吸收、轉(zhuǎn)化和儲存中發(fā)揮著重要的作用，還能夠穩(wěn)定植物體并與土壤形成物理和化學聯(lián)系。有研究學者認為，優(yōu)良根系的品種有利于提高產(chǎn)量穩(wěn)定性、資源利用效率及對環(huán)境脅迫的抵抗力^[1]，根系也被作為育種目標。根系的形態(tài)，例如根長、根系體積、根系直徑和根干物質(zhì)，可以反映根系的健康情況。當植物受到脅迫時，根系會產(chǎn)生一系列生長和發(fā)育、形態(tài)、生物量以及生理生化代謝變化以適應脅迫條件。因此，更好地了解植物根系和根際過程有助于提高植物生產(chǎn)和可持續(xù)土壤管理的資源效率。

根系研究的關鍵在于使植物“隱藏的一半”能被可視化和量化。

常用根系表型研究方法及其成像圖

  傳統(tǒng)植物根系的研究方法包括挖掘法、定位法、土鉆法等，通過挖根、洗根等操作后對根系進行形態(tài)學、生理生化等方面的研究，此類方法不僅破壞性大、耗時長、取樣成本高，且存在一定的局限性^[2]。近年來，無損成像方法在植物科學中變得越來越流行。傳統(tǒng)上局限于RGB成像的高通量應用正在向更寬的光譜范圍發(fā)展，從而能夠?qū)ΩH成分進行化學成像^[3,4]，也為地下根系的研究提供了新的途徑。

  為了解決傳統(tǒng)根系研究方法所存在的缺陷并方便對根系進行成像，市場上出現(xiàn)了一系列產(chǎn)品，如人工培養(yǎng)基（瓊脂、發(fā)芽紙、水培等）培養(yǎng)植物幼苗的方法，但該方法植株的生長條件受到人們的質(zhì)疑；微根窗技術是一種非破壞性、定點直接觀察和研究植物根系的方法，是活體根系監(jiān)測、根系動態(tài)生長監(jiān)測最主要的方法之一。但該方法的缺陷在于窗面及觀察深度都比較有限，且在根系生長過程中可能會產(chǎn)生大量細根圍繞在玻璃管周圍，影響觀測的準確性^[5-7]。因此，基于根窗技術，填土根箱成像系統(tǒng)應運而生，用于植物根系成像。

  基于根箱栽培的植物根系表型RGB成像存在一個缺陷，即需要依賴于根與土壤足夠的對比度才能進行自動分割。而高光譜成像數(shù)據(jù)能夠克服根與土壤分割困難的問題，能夠?qū)Ω当硇图吧誀畛煞诌M行成像分析。

根系表型研究方法對比

根系研究方法	優(yōu)點	缺點	代表性儀器
挖掘法、土鉆法	經(jīng)濟成本低	破壞性；耗時耗力；	WinRhizo洗根圖像分析系統(tǒng)
微根窗法	非破壞性； 定點觀測	窗面尺寸小	MS-190超高清微根窗相機系統(tǒng)
根箱栽培法 -RGB成像	非破壞性； 可實現(xiàn)高通量分析	圖像自動分割依賴于根與土壤的對比度	PlantScreen高通量植物表型系統(tǒng)
根箱栽培法 -高光譜成像	自動圖像分割； 可對根系成分進行化學成像	經(jīng)濟成本略高	RhizoTron?植物根系高光譜成像分析系統(tǒng)

  基于此，易科泰生態(tài)技術公司結(jié)合近幾年來國際先進高光譜成像技術創(chuàng)新應用（易科泰 SpectrAPP ^? 項目）實驗研究，開發(fā)了一款RhizoTron^?植物根系高光譜成像分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于根窗技術，可對RhizoBox根盒培養(yǎng)的植物根系進行原位非損傷表型成像分析，具備多功能高光譜成像分析功能，可對植物根系進行高光譜和自發(fā)光熒光成像。能夠?qū)崿F(xiàn)植物根系進行原位表型高光譜成像分析和動態(tài)監(jiān)測。可應用于植株根系成像分析、抗性篩選及遺傳育種、病蟲害脅迫及干旱研究、土壤結(jié)構(gòu)及養(yǎng)分研究等領域。

2、RhizoTron^?植物根系高光譜成像分析系統(tǒng)

2.1 系統(tǒng)介紹

  RhizoTron^?植物根系高光譜成像分析系統(tǒng)可對生長于RhizoBox根盒（帶根窗）的作物根系進行高光譜成像分析和UV激發(fā)生物熒光成像分析（選配），可選配Thermo-RGB成像分析及冠層表型成像分析。

  RhizoTron植物根系高光譜成像分析系統(tǒng)由主機系統(tǒng)和高光譜成像系統(tǒng)組成，其中主機系統(tǒng)包括系統(tǒng)平臺（主機箱）、控制單元、樣品托、數(shù)據(jù)處理服務器等組成；光譜成像系統(tǒng)由光譜成像單元（包括成像傳感器、光源、云臺等）和自動掃描軸組成。

2.2 功能特點

1）基于RhizoTron^?根窗技術的高光譜成像分析技術，配有植物培養(yǎng)模塊，由樣品托盤、適配器、不同規(guī)格尺寸RhizoBox根系觀測培養(yǎng)根盒組成，或自己制作培養(yǎng)根盒；可選配多通道智能LED培養(yǎng)臺

2）標配為60度傾斜自動掃描成像（與植物培養(yǎng)角度一致），同時對RhizoBox根系和幼苗進行高光譜成像分析和RGB成像分析，可選配其它角度如45度、70度和90度（垂直掃描成像）

3）可對根系進行UV-MCF紫外光激發(fā)生物熒光高光譜成像，以研究分析根系活動及根系與土壤互作關系、熒光假單胞菌等AvrahamAlonyandRaphaelLinker,2013）；或選配根系Thermo-RGB成像分析

4）可選配頂部冠層RGB成像分析、紅外熱成像分析、高光譜成像分析、葉綠素熒光成像分析（可選配適于正常培養(yǎng)盆的樣品托）

5）可選配iPOT數(shù)字化植物培養(yǎng)盆或RhizoBox根系培養(yǎng)盒，持續(xù)監(jiān)測土壤水分溫度、重量、植物生長、光合效率、PI（performanceIndex）、莖流等生理生態(tài)指標，可自動采集土壤滲漏水并進行土壤營養(yǎng)鹽分析

6）模塊式結(jié)構(gòu)，具備強大的系統(tǒng)擴展功能，系統(tǒng)平臺自動萬向腳輪，方便移動

7）可遠程控制（選配）、自動運行數(shù)據(jù)采集存儲等功能

2.3 技術指標

1)控制單元為嵌入式操作系統(tǒng)，可進行雙重控制（觸控屏+PC端全中文GUI軟件），實現(xiàn)遠程操控相機及平臺

2)自動掃描軸推掃速度與精度：1-40mm/s，移動精度1mm，有效掃描范圍：標配100cm

3)高光譜成像（標配400-1000nm，可選配900-1700nm）可成像分析植被生理生化指標、健康指數(shù)、光合利用效率、植被脅迫、水分、氮素等指數(shù)。配備PhenoRoot根系分析軟件，如需對地上部分進行同時分析，可選配SpectrAPP分析軟件

4）標配RGB彩色成像：分辨率2448×2048像素，配備專業(yè)植物根系分析軟件

5）SpectrAPP^?高光譜成像分析軟件：進行光譜融合、ROI選區(qū)分析、光譜分析、頻率直方圖、自動識別不同波段峰值，可分析近百種光譜指數(shù)，根據(jù)需求定制添加光譜指數(shù)，同時能夠分析根系表型數(shù)據(jù)

6）PhenoRoot根系分析軟件，可分析根長、根系最大寬度、凸包面積、根系總長、根系面積（生物量）、根系剖面分析（根系密度）等

7)Thermo-RGB成像融合分析（選配），包括Thermo-RGB融合分析軟件，紅外熱成像分辨率：640×512像素；測量溫度范圍：-25℃－150℃；光譜范圍：7.5－13.5μm

8)多通道智能LED培養(yǎng)臺，RGBW四通道智能調(diào)整LED光源，0-100%可調(diào)，可模擬晝夜節(jié)律、不同光配方等，最大光強300μmol/m²·s

9)葉綠素熒光成像單元（選配），專業(yè)高靈敏度葉綠素熒光成像CCD，幀頻50fps，分辨率720×560像素，像素大小8.6×8.3μm，可自動運行Fv/Fm、Kautsky誘導效應、熒光淬滅分析、光響應曲線等protocols，自動測量分析50多個葉綠素熒光參數(shù)，包括：Fv/Fm、Fv’/Fm’、Y(II)、NPQ、qN、qP、Rfd、ETR等，自動形成葉綠素熒光參數(shù)圖

10)系統(tǒng)平臺規(guī)格：標配約145cm×60cm×160cm（長×寬×高）、重量約50kg

左圖為頂部冠層高光譜成像（NDVI），右圖為根系成像提取（EcoTech^?實驗室提供）

3、應用案例

3.1 甜菜根系RGB及高光譜成像分析：

以甜菜為實驗對象進行了實驗，對其根系進行RGB成像和高光譜成像（900-1700nm），分別進行了形態(tài)分析和生化性狀進行分析^[8]。

1）形態(tài)分析：以手動分割作為參考，使用RGB和高光譜圖像跟蹤甜菜根系的生長、形態(tài)和結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)基于RGB自動分割并不能很好的區(qū)分老根和土壤，跟蹤根系總根長誤差為6.94%；高光譜成像通過光譜比率獲得根系的二值圖像進而對根系長度進行分析，誤差僅為1.5%。使用紫外燈（UV）與模擬太陽光照射得到的根系可視化圖像，發(fā)現(xiàn)在明亮背景下UV圖像更易識別根系。

左：RGB原始圖像；中：(A)使用繪圖板手動分割根系，(B)頂部分割不良的舊根軸區(qū)域，(C)圖像底部正確分割的新根軸，(D)基于RGB獲得的二值圖像；右：基于高光譜獲得的二值圖像

UV和模擬太陽光根系可視化圖像。(A): UV；(B): 模擬太陽光

2）生化性狀分析：對不同發(fā)生位置及成熟度的根系和土壤的平均光譜進行分析，發(fā)現(xiàn)三種根系光譜曲線存在顯著差異，且1100nm附近新側(cè)根與主根出現(xiàn)吸收峰，而老根并未出現(xiàn)。但老根與土壤反射曲線趨勢較一致，在水分吸收區(qū)域（1450nm）附近，根系光譜斜率高于土壤。同時，它使用不同含水量土壤校準根盒的平均光譜進行校準，從而繪制根箱上水分分布圖。

左：三個根ROI(老根和新側(cè)根、主根)和兩個土壤ROI(根箱的頂部和底部)的平均光譜；右：根箱上的水分分布圖。

3.2小麥根系RGB及高光譜成像分析

以小麥為實驗對象，對植株進行扦插處理，扦插后14、28、47、94、101和201天對根箱的上三分之一進行高光譜成像（900-1700nm)和RGB成像，分別進行了形態(tài)分析和生化性狀進行分析^[9]。

1）形態(tài)分析：使用WinRhizo對根長度進行結(jié)構(gòu)量化，以手動分割作為參考，分別使用高光譜圖像和RGB圖像對根系可見根長度進行預測，結(jié)果表示，基于RGB分割為83.4%，光譜分割為77.0%。但兩種分割方法的斜率沒有顯著差異（P=0.225）。表明兩種方法在預測此處使用的基質(zhì)的可見根長度方面具有相似的性能。

通過自動光譜和顏色分割方法預測人工跟蹤的可見根長度

2）生化性狀分析：基于光譜特征，使用決策樹模型對根像素的徑級類別進行預測，其訓練集為r=0.86，驗證集r=048；基于一階導數(shù)差分光譜（1649-1447nm）構(gòu)建根系腐爛時間指數(shù)模型，使用修剪后28天和101天的光譜數(shù)據(jù)作為驗證集，其r²=0.96。

左：根光譜反射率的徑向模型，使用從中心到邊界以0.2 mm增量的八個徑向類的訓練決策樹模型并進行分類。整個根圖像上的白色幀表示頂部和底部特寫部分的位置；右：光譜反射率(一階導數(shù)差譜1649~1447nm)與衰減時間(拍攝后天數(shù))的關系

3.3 土壤含水量估測及根腐病識別

  以甜菜為實驗對象對其根系進行高光譜成像（900-1700nm)，同時測定與實驗相同土壤的根箱中的不同土壤含水量及高光譜成像，以此作為訓練集對含水量模型進行訓練，對根箱的每個土壤像素的含水量進行預測；以油用蘿卜作為實驗對象，使用化學計量分析對根系不同時間后腐爛的光譜特征進行識別，通過光譜的時間變化推斷根系腐爛情況^[10]。

左：根箱土壤含水量預測；右：油用蘿卜覆蓋作物高光譜圖像根系分解分析。(A)上圖:三個時間點的原始光譜和一階導數(shù)。下圖:基于1040和1450 nm一階導數(shù)差分光譜的衰減函數(shù)。(B)所示光譜的三次示例圖像。

3.4不同基因型扁豆霉菌根腐病的RGB和高光譜成像評估

以不同基因型扁豆為實驗對象，分別進行RGB成像和高光譜成像（550-1700nm），研究高通量表型技術評估霉菌根腐病的嚴重程度，以快速鑒別耐藥基因型。設置對照組和實驗組，培養(yǎng)14日后實驗組接種黃芽孢桿菌，對照組施以清水。接種14日后使用0-5疾病評分量表對根系進行評分，作為地面參考數(shù)據(jù)^[11]。

霉菌根腐病嚴重程度量圖

RGB圖像：通過提取特征變量對植物生物量研究，發(fā)現(xiàn)投影面積與植物生物量有很強的相關性，與地下生物量相關性高達0.9，地上生物量相關性為0.84；對根系病害程度進行預測，發(fā)現(xiàn)其R²達到0.67，而通過地上部特征變量進行預測，其R²僅達到0.23。

GH_LSP和GH_RIL小扁豆面板RGB圖像投影面積與植物根、莖干重的相關性

  高光譜圖像：通過提取感興趣區(qū)的光譜，發(fā)現(xiàn)從地上樣品的高光譜反射曲線來看，健康和感染的樣品光譜反射曲線相差較小，而根系的光譜曲線差異較顯著。使用歸一化差異光譜指數(shù)（NDSI）對根系疾病程度進行預測，其R²達到0.54，使用地上部光譜特征進行預測，其R²僅為0.27。

  小扁豆的平均反射光譜(GH_LSP和GH_RIL數(shù)據(jù))。(A)GH_LSP基因型小扁豆新梢的平均光譜曲線。(B)GH_RIL基因型小扁豆新梢的平均光譜曲線。(C)GH_LSP基因型小扁豆根系的平均光譜曲線。(D)GH_RIL基因型小扁豆根系的平均光譜曲線。

小扁豆葉、根圖像RGB和高光譜特征的預測性能。

	Region of interest	Training set	Test set	R2	RMSE
RGB	shoot	GH_LSP(80%)	GH_LSP(20%)	0.53	0.88
	root			0.73	0.66
高光譜	shoot			0.27	1.08
	root			0.54	0.86

 

3.5 油菜重金屬鉛(Pb)含量的高光譜估測

以油菜為實驗對象，對葉片和根系分別進行高光譜成像，對根系圖像進行比值運算（根部：861.96/480.46nm），油菜葉片和根的分割閾值t分別為1.3和1.6，使根系與背景進行圖像分割。分別建立支持向量機（SVM）和SAE深度神經(jīng)網(wǎng)絡對樣品中的鉛（Pb）含量建立模型并預測，發(fā)現(xiàn)SAE深度神經(jīng)網(wǎng)絡模型精度較高。在SAE模型的基礎上使用遷移學習的方法得到T-SAE模型，并對油菜葉片和根系中的Pb含量進行預測，發(fā)現(xiàn)其精度有所提升，油菜葉片達到0.92，根系達0.93?；诖丝梢园l(fā)現(xiàn)高光譜成像技術結(jié)合深度神經(jīng)網(wǎng)絡能夠?qū)τ筒酥参镏械闹亟饘貾b進行定性定量檢測^[12]。

不同鉛濃度脅迫下油菜樣品的高光譜曲線。注:(A)和(B)分別代表油菜葉片和根系的ROI高光譜信息。此外，(C)和(D)分別代表了不同鉛脅迫下油菜葉片和根系ROI的平均高光譜信息。

鉛含量預測的最佳T-SAE模型。注:(A)和(B)分別代表了用T-SAE模型預測油菜葉片和根系鉛含量的最佳結(jié)果。

3.6 野生植物幼苗根系高光譜成像分析

  易科泰EcoTech^?實驗室技術人員以一株野生型元寶槭幼株為樣本，采集900-1700nm高光譜數(shù)據(jù)，并對其進行光譜成像分析及根系形態(tài)分析。

左：樣本RGB照片；中：歸一化氮素指數(shù)（NDNI）；右：比值指數(shù)R₁₁₀₀/R₁₄₅₀

植株不同部位的900-1700nm反射光譜

基于SpectrAPP軟件的根系分析結(jié)果。左圖為R1100/R1450，顯示了根系不同部位的水分分布狀態(tài)，右圖為根系形態(tài)分析結(jié)果

4、參考文獻

[1] Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleurop?ischer Ackerunkr?uter und Kulturpflanzen. DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main (1960).；Kenrick, P., & Strullu-Derrien, C. Theorigin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).

[2] 秦天元, 孫超, 畢真真等. 植物根系成像技術研究進展及馬鈴薯根系研究應用前景[J]. 核農(nóng)學報, 2019, 33(02): 412-419.

[3] Dhondt S, Wuyts N, Inzé D. Cell to whole-plant phenotyping: the best is yet to come. TrendsPlant Sci. 2013; 18:428–39.

[4] Pierret A. Multi-spectral imaging of rhizobox systems: new perspectivesfor the observation and discrimination of rhizosphere components. Plant Soil. 2008; 310: 263–8.

[5] Vamerali T, Ganis A, Bona S, Mosca G． An approach to minirhizotron root image analysis［J］． Plant and Soil, 1999, 217( 1/2) : 183－193.

[6] Johnson M G, Tingey D T, Phillips D L, Storm M J. Advancing fine rootresearch with minirhizotrons [J].Environmental and Experimental Botany, 2001, 45( 3) : 263－289.

[7] 秦天元, 孫超, 畢真真等. 植物根系成像技術研究進展及馬鈴薯根系研究應用前景[J]. 核農(nóng)學報, 2019, 33(02):412-419.

[8] Gernot B , Mouhannad A , Alireza N , et al. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setupand Imaging Protocols. [J]. Journal of visualized experiments : JoVE, 2017, (126).

[9] Gernot B, Alireza N, Thomas A, et al. Hyperspectral imaging: a novel approach for plant root phenotyping.[J]. Plantmethods, 2018, 14(1).

[10] Gernot B , Mouhannad A , Alireza N . Root System Phenotying ofSoil-Grown Plants via RGB and Hyperspectral Imaging. [J].Methods in molecularbiology (Clifton, N.J.), 2021, 2264245-268.

[11] Advanced Imaging for Quantitative Evaluation of Aphanomyces RootRot Resistance in Lentil[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 10.

[12] Nakaji T, Noguchi K, Oguma H. Classification of rhizosphere components using visible–near infrared spectral images. Plant Soil. 2008; 310: 245–61.